制备方法

方法一、重组TNFα的工艺过程细菌发酵 将工程菌接种于LB培养基，37℃震荡培养至A600nm=1，转至M9培养基，于42℃诱导4h。离心，收集菌体。用pH为8的磷酸盐缓冲液(PB，10mmol/L)悬浮菌体，并用超声破碎菌体，离心收集上清液，对PB透析，得TNFα粗品。工程菌[培养、发酵]→[37℃、42℃]发酵菌体[10mmol/L PB]→[pH8]TNFα粗品DEAE-Sepharose FF 离子交换柱层析 离子交换柱用PB平衡，加TNFα粗品，用PB洗柱，再加75 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性。TNFα粗品[DEAE-Sepharose FF离子柱]→[75 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IQ-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH 8、20 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后加TNFα活性组分I，用80 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性，得TNFα活性组分II。TNFα活性组分I[Q-Sepharose FF离子柱]→[80 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IICM-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH为6的10mmol/L PB平衡，加TNFα活性组分II，再依次用该PB液、PB液加200mmol/L NaCl及PB液加600 mmol/L NaCl分步洗脱，收集各洗脱液，测TNFα活性，即得TNFα纯品(在4℃时，通过三次常压离子交换，电泳表明：PB液加600 mmol/L NaCl的洗脱峰为TNFα单一条带，可得TNFα纯品)。TNFα活性组分II[CM-Sepharose FF离子柱]→[PB、200及600mmol/L NaCl]TNFα纯品方法二、对合成的TNFα突变改造突变改造 用多位点突变引物和PCR方法对合成的TNFα基因突变改造，使其第二位精氨酸密码子CGT变为赖氨酸密码子AAA，即得突变基因TNF-K2。TNFα基因[多位点突变引物、PCR方法]→TNF-K2转化、重组 将TNF-K2插入载体pSB-92的PL启动子下游，转化E．coliJM103，经酶切鉴定筛选转化子，得重组质粒pSB-TNF-K2。TNF-K2[pSB-92]→pSB-TNF-K2培养、诱导 将pSB-TNF-K2于30℃培养至对数生长期，于42℃诱导4h，即得突变体[Lys2]TNFα，其分子量为17kD，比活性为6.8×107U/mg 蛋白，是一种可溶性蛋白质。pSB-TNF-K2[30℃, 42℃, 4h]→[Lys2]TNFα.

合成制备方法

方法一、重组TNFα的工艺过程
细菌发酵 将工程菌接种于LB培养基，37℃震荡培养至A600nm=1，转至M9培养基，于42℃诱导4h。离心，收集菌体。用pH为8的磷酸盐缓冲液(PB，10mmol/L)悬浮菌体，并用超声破碎菌体，离心收集上清液，对PB透析，得TNFα粗品。
工程菌[培养、发酵]→[37℃、42℃]发酵菌体[10mmol/L PB]→[pH8]TNFα粗品
DEAE-Sepharose FF 离子交换柱层析 离子交换柱用PB平衡，加TNFα粗品，用PB洗柱，再加75 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性。
TNFα粗品[DEAE-Sepharose FF离子柱]→[75 mmol/L NaCl]TNFα活性组分I
Q-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH 8、20 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡，然后加TNFα活性组分I，用80 mmol/L NaCl洗脱，收集各峰，测TNFα活性，得TNFα活性组分II。
TNFα活性组分I[Q-Sepharose FF离子柱]→[80 mmol/L NaCl]TNFα活性组分II
CM-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH为6的10mmol/L PB平衡，加TNFα活性组分II，再依次用该PB液、PB液加200mmol/L NaCl及PB液加600 mmol/L NaCl分步洗脱，收集各洗脱液，测TNFα活性，即得TNFα纯品(在4℃时，通过三次常压离子交换，电泳表明：PB液加600 mmol/L NaCl的洗脱峰为TNFα单一条带，可得TNFα纯品)。
TNFα活性组分II[CM-Sepharose FF离子柱]→[PB、200及600mmol/L NaCl]TNFα纯品
方法二、对合成的TNFα突变改造
突变改造 用多位点突变引物和PCR方法对合成的TNFα基因突变改造，使其第二位精氨酸密码子CGT变为赖氨酸密码子AAA，即得突变基因TNF-K2。
TNFα基因[多位点突变引物、PCR方法]→TNF-K2
转化、重组 将TNF-K2插入载体pSB-92的PL启动子下游，转化E．coliJM103，经酶切鉴定筛选转化子，得重组质粒pSB-TNF-K2。TNF-K2[pSB-92]→pSB-TNF-K2
培养、诱导 将pSB-TNF-K2于30℃培养至对数生长期，于42℃诱导4h，即得突变体[Lys2]TNFα，其分子量为17kD，比活性为6.8×107U/mg 蛋白，是一种可溶性蛋白质。
pSB-TNF-K2[30℃, 42℃, 4h]→[Lys2]TNFα.

用途简介

用作银量法的吸附指示剂和生物染色剂。主要用于抗肿瘤和抗病毒综合征的治疗。

用途

用作银量法的吸附指示剂和生物染色剂。主要用于抗肿瘤和抗病毒综合征的治疗。

WGK_Germany：

3
德国有关水污染物质的分类清单

危险类别码：

R36

安全说明：

S22-S24/25-S37/39-S26

RTECS号：

LM5920000

安全标志：

S22:不要吸入粉尘。
S24/25:防止皮肤和眼睛接触。

危险标志：

Xi:Irritant;

CHEMICAL IDENTIFICATION

RTECS NUMBER :

LM5920000

CHEMICAL NAME :

Fluorescein, 4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-tetraiodo-, disodium salt

CAS REGISTRY NUMBER :

632-69-9

LAST UPDATED :

199701

DATA ITEMS CITED :

5

MOLECULAR FORMULA :

C20-H2-Cl4-I4-O5.2Na

MOLECULAR WEIGHT :

1017.60

HEALTH HAZARD DATA

ACUTE TOXICITY DATA

TYPE OF TEST :

TDLo - Lowest published toxic dose

ROUTE OF EXPOSURE :

Oral

SPECIES OBSERVED :

Rodent - mouse

DOSE/DURATION :

707 gm/kg/2Y-C

TOXIC EFFECTS :

Tumorigenic - neoplastic by RTECS criteria Endocrine - thyroid tumors

REFERENCE :

JJIND8 JNCI, Journal of the National Cancer Institute. (Washington, DC) V.61-79, 1978-87. For publisher information, see JNCIEQ. Volume(issue)/page/year: 77,277,1986 ** REPRODUCTIVE DATA **

TYPE OF TEST :

TDLo - Lowest published toxic dose

ROUTE OF EXPOSURE :

Oral

DOSE :

650 mg/kg

SEX/DURATION :

female 8-20 day(s) after conception

TOXIC EFFECTS :

Reproductive - Effects on Embryo or Fetus - fetotoxicity (except death, e.g., stunted fetus)

REFERENCE :

OYYAA2 Oyo Yakuri. Pharmacometrics. (Oyo Yakuri Kenkyukai, CPO Box 180, Sendai 980-91, Japan) V.1- 1967- Volume(issue)/page/year: 24,391,1982

TYPE OF TEST :

TDLo - Lowest published toxic dose

ROUTE OF EXPOSURE :

Oral

DOSE :

400 mg/kg

SEX/DURATION :

female 8-15 day(s) after conception

TOXIC EFFECTS :

Reproductive - Effects on Newborn - growth statistics (e.g.%, reduced weight gain)

REFERENCE :

OYYAA2 Oyo Yakuri. Pharmacometrics. (Oyo Yakuri Kenkyukai, CPO Box 180, Sendai 980-91, Japan) V.1- 1967- Volume(issue)/page/year: 24,391,1982

TYPE OF TEST :

TDLo - Lowest published toxic dose

ROUTE OF EXPOSURE :

Oral

DOSE :

20 gm/kg

SEX/DURATION :

female 8-15 day(s) after conception

TOXIC EFFECTS :

Reproductive - Effects on Newborn - weaning or lactation index (e.g., # alive at weaning per # alive at day 4)

REFERENCE :

OYYAA2 Oyo Yakuri. Pharmacometrics. (Oyo Yakuri Kenkyukai, CPO Box 180, Sendai 980-91, Japan) V.1- 1967- Volume(issue)/page/year: 24,391,1982

毒理学数据：

1、   生殖毒性：雌性大鼠（口服）：LDLo：650mg/kg/日