通用原则：

1， 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。

2， 扩增子的长度应不超过400bp，理想的*能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。

4， 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

5， 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

b），探针设计指导

1，在设计引物之前设计探针

2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。

3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在

4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

6， 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。

7， 检测探针的DNA折叠和二级结构。

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